干细胞双胞胎可以研究疾病

以Knut Woltjen博士为首的研究人员报道了一种新的基因编辑方法，可以绝对准确地修改人类基因组中的单个DNA碱基。

这项技术在《自然通讯》(Nature Communications)中有所描述，它的独特之处在于它提供了成对的基因匹配细胞，通过设计细胞自身的修复机制来研究疾病相关的突变。

DNA单突变(简称单核苷酸多态性——或SNP)是人类基因组中最常见的突变类型。已知超过1000万个SNP，其中许多与阿尔茨海默病、心脏病和糖尿病等疾病有关。

为了了解SNP在遗传性疾病中的作用，来自京都大学iPS细胞研究和应用中心(CiRA)的科学家从患者供体中创造了诱导多能干细胞。

IPS细胞保留了供体的遗传组成，可以在体内转化为任何细胞类型。这样，来自组织(如大脑、心脏或胰腺)的细胞可以在实验室中被创造和观察，这样新的疾病治疗方法就可以在开始临床试验之前得到安全的测试。

要证明SNP导致疾病，需要与基因匹配或同源的iPS细胞进行非常严格的比较。理想细胞是研究人员描述的同卵“双胞胎”；基因组仅相差一个单核苷酸多态性的细胞。

然而，由Woltjen实验室特别任命的助理教授、该研究的共同第一作者Shin-Il Kim博士说，创造这些双胞胎并不容易。

“通常我们需要添加抗生素抗性基因和SNP来克服效率低的问题。因为这增加了基因组的另一个变化，我们需要一种方法来消除它。”

为了创造同卵双胞胎，Woltjen实验室开发了一种新的基因组编辑技术，插入SNP修饰和荧光报告基因作为信号检测修饰细胞。

他们还在报告基因的左右两侧设计了一个短的重复DNA序列，称为微同源性，以及CRISPR(一种切割DNA的酶)的独特靶位。

这些特性使得研究人员可以利用细胞的内源性DNA修复系统，即微同源介导的末端连接(MMEJ)来精确去除报告基因。MMEJ去除了荧光报告基因，只留下了修饰的SNP。通过在一个微观同源性中排列突变单核苷酸多态性，在另一个微生物学中排列正常单核苷酸多态性，该方法有效地产生同卵双胞胎。

CiRA的副教授Knut Woltjen博士称这种新的基因编辑方法为MhAX，即微同源辅助切除。Woltjen的灵感来自于观察自然的MMEJ修复来应对DNA损伤。

“为了让MhAX发挥作用，我们复制了基因组中已经存在的DNA序列。然后我们让细胞解决这个复制问题。同时，细胞决定修复后哪些单核苷酸多态性仍然存在，”他说。"一项实验产生了所有可能的单核苷酸多态性基因型."

在广岛大学山本贵司博士和庆应义塾大学Soga tomoyshi博士的合作下，Woltjen实验室利用MhAX在HPRT和APRT基因中创建SNP，突变分别与痛风和肾脏疾病有关。

生化分析显示，具有HPRT突变SNP的细胞具有与患者相似的代谢变化，而在同一实验中衍生的相同双胞胎对照细胞是正常的。APRT * J突变在急性肾衰竭患者中很常见，这证明了MhAX的高效性，因为两个基因拷贝(一个来自母亲，一个来自父亲)需要基因编辑来研究突变的影响。

Woltjen的实验室已经开始应用他们的方法来创建和纠正与其他疾病相关的基因中的SNPs。他们与和加拿大的研究人员合作，正在调查青少年严重糖尿病的遗传原因。

目前，利用胚胎干细胞进行糖尿病临床试验正在进行中，但需要慢性免疫抑制。患者自身iPS细胞的基因矫正，可能导致产生胰岛素的健康胰腺细胞的来源，降低移植后发生排斥反应的可能性。

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