利用基于质谱的蛋白质组学研究人类疾病

你在沃尔特和伊莱扎霍尔研究所实验室的关键领域是什么？

我们是澳大利亚领先的医学研究机构之一。我经营蛋白质集团的平台技术实验室。作为一个研究机构，我们的大部分研究都集中在癌症、免疫紊乱和传染病上。然而，最近，我们的研究重点已经发展到健康发育和衰老。该研究所有93个实验室和1000多名员工，涵盖各种疾病。员工的数量意味着我们必须有高吞吐量。有这么多员工，考虑我们的基础设施以及如何最大限度地提高产量非常重要。

随着时间的推移，实验室里发生的一件事是，我们需要检测蛋白质的形式。考虑PTM效应和其他翻译后效应时存在的蛋白质形式。

我们投入了大量资金来了解蛋白质形式的生理功能，并开发技术来更好地检测它们。目前，我们正在使用质谱仪，但我们知道我们只是看到了冰山一角。虽然这些仪器非常灵敏，但动态范围是主要的限制因素，因为我们知道我们分析的细胞和许多生物液体中的动态范围比我们可以检测的范围大得多。

为什么理解PTM的影响很重要？

大多数医学研究实验室使用自下而上的蛋白质组学，通常侧重于以基因为中心的方式使用蛋白质组学(蛋白质碱基定量)。在我们的实验室中，因为我们与许多细胞信号转导组一起工作，许多与我们合作的蛋白质在翻译后都被修饰了，所以对我们来说，在不同条件下监测这些PTM变化是非常重要的。我们通常在蛋白质的背景下考虑PTM，这种蛋白质体现在“蛋白质形式”的概念中，我们对化学修饰基因产物的功能版本的分子真正感兴趣。

在给定的时间点，我们可以检测到任何细胞中表达的大约11，000到13，000个基因产物。翻译后修饰可以通过RNA编辑或编码不同的SNPs、转录调节、截短、蛋白酶切割或化学修饰如磷酸化来进行。有超过107种已知的内源性翻译后修饰。这些蛋白质样本的复杂性可能是天文数字。话虽如此，我预计在任何时间点，给定细胞的蛋白质形式可能约为1000万。

在我的实验室里，我们的目标是深入研究并尽可能多地关注这些基于PTM的蛋白质形式。如果我们能进行非常深入的测量，我相信我们可以开始将翻译后修饰的蛋白质与一些表型联系起来。这接近于理解为什么我们会看到表型的差异。

分析蛋白质形式的最佳方法是什么？

分析这些蛋白质形式和可能的不同蛋白质形式的最佳方法之一是分析完整的蛋白质。几年前，当我们开发出一种高通量高效纯化蛋白质的方法时，我们致力于这项工作。

我们使用顺磁珠作为成核剂来沉淀我们的蛋白质形式。如果您熟悉树脂基SP3法，可以使用这种方法，但需要额外的洗脱步骤。因此，我们从蛋白质聚集领域获得了一些知识，并结合甲酸以非常有效和无偏见的方式提取和纯化蛋白质。当你这样做的时候，你最终会得到一个非常健壮和高度可重复的方法来释放完整的蛋白质用于质谱分析。

来自液相色谱分离的MS1信号提供了我们可以在单枪中检测到的所有完整蛋白质的测量值。平均而言，一次注射可以检测到大约2000种不同形式的蛋白质，揭示了令人难以置信的基因产物的异质性阵列。

我们发现，平均而言，蛋白质以大约八种不同的形式存在(PTM形式)。因此，当使用自下而上的蛋白质组学时，我们知道我们所寻找的是真正蛋白质的冰山一角。我们知道蛋白质形式的功能异质性比我们目前在这个领域所知道的要多得多。

如果有更深入研究这一点的方法就太好了！我们知道这只是开始，因为当你考虑分析完整的蛋白质时，信号强度通过同位素和电荷状态的分布非常分散，这意味着我们的动态范围是有限的，而且我们对深度挖掘的能力有严格的限制，所以我们可以使用这种方法进入蛋白质地层。

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